iPS誘導多能幹細胞引領人腦類器官新突破：迷你大腦“長眼睛”了

類器官

（Organoids）

是一種類似於組織器官，由

不同型別幹細胞加入相應培養基配方，透過某種支援介質

在體外細胞培養系統製備，產生

類似體內器官結構和功能的三維“微器官模型”。

與傳統

僅能得到單層細胞的二維培養

模式相比，透過三維培養能得到具有

立體空間結構，涵蓋多種型別且成熟度較高的細胞，所形成的“微器官”具有功能性，能在體外模擬器官組織的發生過程及生理病理狀態。

因而在

疾病模型建立、藥物毒理篩選、基因和細胞療法服務

等領域具有廣闊的應用前景。

△ 類器官的產生和治療潛能

類器官技術的誕生，無疑為科學家研究各種組織的功能提供了更為強大的工具。

為構建類器官與原生組織結構的相似性，其培養重要條件之一：

幹細胞或器官祖細胞的發育，對類器官的培養尤為重要。

由日本Shinya Yamanaka團隊開發，於2012年獲得諾貝爾獎技術的

誘導多能幹細胞（iPSCs），是一種利用編碼轉錄因子四種特定基因引入成熟體細胞，實現重程式設計為無限繁殖、在體內具有產生所有細胞型別

的多能幹細胞。其相比胚胎幹細胞能

完美繞開 “倫理之爭”

，同時又兼具

與自體匹配幹細胞系無限繁殖、多向分化潛能。

因而，

iPSCs已成為類器官培育主要的組織幹細胞來源。

△ iPSC構建類器官培養體系

目前，基於iPSCs類器官技術已成功培養出大量具有部分關鍵生理結構和功能的類組織器官，如

腎臟、肝臟、肺、腸、大腦、前列腺、胰腺和視網膜等。

神經系統疾病由於

發病機制及治療範圍有限

，與其他疾病領域相比，藥物治療改進效率依然較低。隨著幹細胞技術發展與推廣，

培養人大腦類器官成為目前神經科學研究領域炙手可熱的研究專案。

人腦類器官（human brain organoids）是

iPSCs在模擬大腦發育環境培養液中分化產生的類似人腦三維組織。

在結構中，iPSC誘導為擬胚體 （Embryoid Body， EB），在外胚層形成後，引導分化為

神經或非神經

方向。引導分化法獲得類器官依賴分化過程中

新增的生長因子

，得到腦區特異性的區域如皮層、海馬、中腦、大腦。引導分化法得到的類器官含有

神經祖細胞、神經元、星形膠質細胞

及其他大腦細胞。

△ 人腦類器官培養方法，培養皿中“人類大腦”，發育似5周嬰兒

2021年3月，加州大學洛杉磯分校

Daniel H. Geschwind

教授和斯坦福大學

Sergiu P. Pașca

教授，在

Nature Neuroscience

發表最新成果，建立可長時間培養，

具有自我成熟能力的大腦類器官，其中關鍵基因，蛋白，表觀遺傳等變化，

基本完全模擬胎兒直至產後的大腦皮質發育過程。

△ Nature Neuroscience研究成果發表

加州大學和斯坦福大學的科學家

創新性地開發了可以自我成熟大腦皮質類器官，能夠使用離體模型模擬體內神經發育過程，

為研究神經發育不全、精神類疾患、神經退行性疾病等，提供了模擬的研究工具。

△ 該試驗大腦類器官培養過程

隨著技術發展，諸多團隊嘗試用不同方法培養腦區特異性類器官後將其共培養，以得到更完善的腦組織，使之會自我融合形成含有不同腦區的類器官模型（如眼睛），從而用於研究腦各區間的相互作用，以便全方位研究類人腦三維組織的發育、疾病或藥物效果。

作為人腦在胚胎髮育重要部分之一，眼睛的發育是一個非常複雜的過程。現階段雖已有利用

iPSC成功誘匯出純粹的視網膜類器官可以組裝視泡樣結構，但其功能和結構與在體內正常發育的視泡相差甚大。

△ 大腦皮層和視網膜

在正常胚胎髮育過程中，

視網膜原基起源於前腦區域的間腦兩側，隨後突出隆起並在間腦遠端內陷，進而產生視泡。

因此，科學家們初步猜想：

視網膜類器官的不完善可能與大腦前腦區域組織缺失有關。

△ 視網膜在胚胎中發育過程

因此，充分理解視網膜胚胎中發育過程，不僅有助於研究人腦發育過程中“腦-眼”相互作用，也對於早期視網膜疾病的研究意義重大。

2021年8月17日，來自德國杜賽爾多夫海因裡希海涅大學

Jay Gopalakrishnan

團隊在

Cell Stem Cell

雜誌線上發表了題為Human brain organoids assemble functionally integrated bilateral optic vesicles的研究論文。

透過修改將iPSC轉化為神經組織的培養條件，研究人員成功地在大腦類器官中誘匯出了雙側對稱視杯（optic cup，視覺系統的組成部分之一），並發現這種結構可以感知光線，同時將訊號傳送給大腦的其他區域。

△ Cell Stem Cell試驗成果發表

相比以往研究試驗，該試驗人員對培養條件進行了調整：首先採用一個

較低細胞密度（誘導產生一個類器官iPSCs起始數量為1×104）

開始誘導培養；隨後在神經外胚層擴充套件時期，在培養基中新增

不同濃度（0-120 nM）醋酸視黃醇（retinol acetate）

。

培養第30天左右

，新增60nM醋酸視黃醇的組織中產生

“顏色結構”

，

可能就是原始的“眼睛”

。透過免疫熒光染色，研究者在這些類器官的

有色區域檢測到眼睛相關標識基因：RAX，Pax6和FOXG1的明顯表達。

進一步分析發現，在SOX2陽性的內陷區域，FOXG1呈現梯度表達。

說明這些類器官中的視覺區域與前腦區分離，與人胚胎髮育過程中的眼睛發育過程一致。

△ 視泡腦類器官（OVB-Organoids）培養步驟

當這些類器官培養到

50-60天

，原始“眼睛”發展成為了一個或兩個成熟可見

類視神經泡結構

，該類器官被稱為

視泡腦類器官（optic vesicle brain organoids, OVB-organoids）

。同時，研究者利用來自於5個不同捐贈者（donors）共

20批次iPSCs穩定誘導產生了高度可重複性OVB類器官

（成功率：donor 1 - 91%；donor 2 - 65%； donor 3 - 70%； donor 4 - 43%； donor 5 - 40%）。

△ 具有雙側對稱視泡大腦類器官（培養60天）

進一步研究發現，OVB類器官中包含豐富的

神經細胞群

（神經元、小膠質細胞和視網膜細胞等）

及

非神經細胞群（例如晶狀體和角膜組織）。將OVB中視覺結構與胚胎視網膜和視網膜類器官進行比較，發現三者細胞類群特徵極其相似。

隨後，為證實OVB類器官中是否存在

成熟的、有功能的神經元

，研究人員透過

全細胞膜片鉗記錄實驗

對OVB類器官中“眼睛”進行深入探索，發現某些動作電位對河豚毒素（TTX，鈉通道抑制劑）時而敏感時而抵抗，說明

OVB類器官中的神經元細胞是有功能，其中有一部分是視網膜細胞（特異性表達TTX抵抗的電控鈉通道）

。透過

視網膜電圖記錄實驗（ERG）

對視網膜訊號進行了量化分析，發現隨著光強度增加，ERG振幅增大，說明

OVB類器官能對光線做出反應。

隨後分析發現，OVB類器官中

視網膜結構與大腦相應區域相連，能將光感訊號透過電活性傳遞到大腦其他區域神經元網路中。

雖然該試驗，目前OVB類器官

只能存活60天，

時間較短。但該研究

首次成功將視網膜結構在功能上整合到大腦類器官中，在體外系統中再現了視網膜神經節的神經纖維向外延伸，與大腦目標區域相連線的過程。

這一系統可以幫助人們研究

胚胎髮育過程中“腦-眼”相互作用，同時為視網膜疾病（如黃斑變性）的發生機制探究和治療提供強有力工具，極大推動視網膜類疾病治療技術的發展。